アデノ随伴ウイルスと遺伝子治療
アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus: AAV）は、遺伝子治療の分野で最も注目されているウイルスベクターの一つです。このウイルスは、ヒトや霊長類に感染する小型（約20nm）のDNAウイルスで、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に分類されます。名前の通り、アデノウイルスの存在下で効率的に増殖するヘルパー依存型のウイルスです。
AAVの最大の特徴は、病原性がほとんど確認されていないことと、非常に弱い免疫反応しか引き起こさないことです。これらの特性により、遺伝子治療用ベクターとして理想的な選択肢となっています。AAVは分裂期の細胞だけでなく、非分裂期の細胞にも遺伝子を導入できるため、様々な組織や細胞を標的とした治療に応用可能です。
現在、AAVベクターを用いた遺伝子治療薬はいくつか実用化されており、脊髄性筋萎縮症や遺伝性網膜ジストロフィーなどの治療に使用されています。2012年には、リポ蛋白リパーゼ欠損症の治療薬として欧州で初めて承認され、遺伝子治療の実用化に大きな一歩を記しました。
アデノ随伴ウイルスの構造とゲノム特性
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、非常にシンプルな構造を持つウイルスです。直径約20nmの小型ウイルスで、エンベロープ（脂質二重膜）を持たず、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻に覆われています。このカプシドは、VP1、VP2、VP3という3種類のタンパク質から構成されており、正二十面体の対称性を持っています。
AAVのゲノムは、約4.7キロベースの一本鎖DNAで、両端に逆方向末端反復配列（ITR: Inverted Terminal Repeat）を持っています。このITRは、AAVの複製や宿主ゲノムへの組み込みに重要な役割を果たします。ゲノムの中央部分には、主に2つの遺伝子領域があります。
- rep遺伝子: ウイルスの複製に必要なタンパク質をコードしています
- cap遺伝子: カプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3）をコードしています
遺伝子治療用のAAVベクターでは、これらの遺伝子を取り除き、その代わりに治療用遺伝子を挿入します。ITRのみを残すことで、ウイルスとしての複製能力はなくなりますが、遺伝子導入能力は維持されます。
AAVの特筆すべき特徴として、宿主ゲノムへの組み込みが稀であることが挙げられます。多くの場合、AAVゲノムは細胞核内でエピソーム（染色体外DNA）として長期間維持されます。これにより、挿入変異によるがん化リスクが低減され、安全性の高い遺伝子導入が可能となっています。
アデノ随伴ウイルスの血清型と組織特異性
アデノ随伴ウイルス（AAV）には、現在までに13種類以上の血清型（セロタイプ）が同定されており、それぞれ異なる組織への親和性（トロピズム）を示します。この特性は遺伝子治療において非常に重要で、標的とする組織に応じて最適な血清型を選択することで、治療効果を最大化できます。
主要なAAV血清型と組織特異性の関係は以下の通りです。
| 血清型 | 主な標的組織 | 特徴 |
|---|---|---|
| AAV1 | 骨格筋、中枢神経系 | 筋肉への高い遺伝子導入効率 |
| AAV2 | 中枢神経系、網膜、腎臓 | 最も研究が進んでいる血清型 |
| AAV5 | 中枢神経系、肺、網膜 | 上皮細胞への親和性が高い |
| AAV8 | 肝臓、心臓、骨格筋 | 肝臓への非常に高い親和性 |
| AAV9 | 中枢神経系、心臓、肝臓 | 血液脳関門を通過可能 |
例えば、肝臓を標的とした遺伝子治療ではAAV8が頻繁に使用され、中枢神経系疾患の治療ではAAV9が選択されることが多いです。また、網膜疾患の治療にはAAV2やAAV5が有効とされています。
近年では、自然界に存在するAAV血清型だけでなく、人工的に改変したAAVベクターの開発も進んでいます。これらの改変型AAVは、特定の組織への親和性を高めたり、中和抗体から逃れる能力を付与したりすることで、遺伝子治療の効率と安全性を向上させています。
アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入の方法と手順
アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いた遺伝子導入は、複数のステップから成る精密なプロセスです。ここでは、実験室レベルでのAAVベクター作製から遺伝子導入までの一般的な手順を解説します。
1. AAVベクターの準備
まず、3種類の重要なプラスミドを準備します。
- AAVベクタープラスミド: 目的遺伝子（GOI）とプロモーターを含み、両端にITR配列を持つプラスミド
- AAVヘルパープラスミド: AAVのカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド
- アデノウイルスヘルパープラスミド: AAVの複製に必要なアデノウイルス由来の補助遺伝子を含むプラスミド
2. HEK293細胞へのトランスフェクション
上記3種類のプラスミドをHEK293細胞（ヒト胎児腎細胞由来の細胞株）に同時にトランスフェクションします。トランスフェクション試薬としては、リン酸カルシウム法やリポフェクション法などが一般的に使用されます。
3. AAVの産生と回収
トランスフェクションから48〜72時間後、細胞内でAAVベクターが産生されます。細胞を回収し、凍結融解や超音波処理などの方法で細胞を破砕し、AAVベクターを放出させます。
4. AAVの精製と濃縮
密度勾配遠心法やイオン交換クロマトグラフィーなどの方法を用いて、AAVベクターを精製します。その後、限外濾過などの方法で濃縮します。
5. ウイルス力価の測定
定量PCRやELISA法などを用いて、精製したAAVベクターの力価（ウイルス粒子数や感染性単位）を測定します。
6. 標的細胞・組織への投与
目的に応じた方法（in vitroの場合は培地への添加、in vivoの場合は静脈内注射や局所注入など）でAAVベクターを投与します。
7. 遺伝子発現の確認
AAVベクターの投与から数日〜数週間後、標的細胞・組織における目的遺伝子の発現をqRT-PCR、ウェスタンブロット、免疫染色などの方法で確認します。
AAVを用いた遺伝子導入の大きな利点は、長期間にわたる安定した遺伝子発現が得られることです。多くの場合、AAVゲノムは宿主細胞の核内でエピソームとして長期間維持され、数ヶ月から数年にわたって目的遺伝子の発現が持続します。
アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子治療の臨床応用
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子治療は、様々な疾患に対する臨床応用が進んでいます。特に単一遺伝子疾患（モノジェニック疾患）に対する治療効果が顕著で、いくつかの治療薬はすでに承認され臨床で使用されています。
承認済みのAAVベクター遺伝子治療薬
- Glybera（アリポジェンチパルボベク）: 2012年に欧州で承認された世界初のAAVベクター遺伝子治療薬。リポ蛋白リパーゼ欠損症の治療に使用されます。AAV1ベクターを使用しています。
- Luxturna（ボレチゲン ネパルボベク）: 2017年に米国FDAで承認された、RPE65遺伝子変異による遺伝性網膜ジストロフィーの治療薬。AAV2ベクターを使用し、網膜下に直接投与します。
- Zolgensma（オナセムノジーン アベパルボベク）: 2019年に承認された脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療薬。AAV9ベクターを使用し、SMN1遺伝子を導入します。一回の静脈内投与で長期的な治療効果が期待できます。
臨床試験中のAAV遺伝子治療
現在、様々な疾患に対するAAVベクター遺伝子治療の臨床試験が進行中です。
- 血友病: 血液凝固因子VIII（血友病A）やIX（血友病B）の遺伝子をAAV8などで肝臓に導入する治療
- パーキンソン病: ドーパミン産生に関わる酵素遺伝子をAAV2で脳内に導入する治療
- 先天性代謝疾患: フェニルケトン尿症やウィルソン病などに対する治療
- 神経変性疾患: アルツハイマー病やハンチントン病などに対する治療
- 心不全: SERCA2a遺伝子などを導入し心機能を改善する治療
これらの臨床試験では、AAVベクターの安全性と有効性が評価されています。特に、長期的な遺伝子発現の持続性や免疫応答の制御が重要な課題となっています。
AAVベクター遺伝子治療の大きな利点は、一回の投与で長期的な治療効果が期待できることです。従来の薬物療法では継続的な投与が必要な疾患でも、AAV遺伝子治療では一度の治療で数年から場合によっては生涯にわたる効果が得られる可能性があります。
アデノ随伴ウイルスの安全性と課題：免疫応答とゲノム編集への展開
アデノ随伴ウイルス（AAV）は遺伝子治療において高い安全性を示すものの、いくつかの課題も存在します。これらの課題を理解し、対策を講じることが、AAV遺伝子治療の更なる発展には不可欠です。
免疫応答の問題
AAVに対する免疫応答は主に2つの形で現れます。
- 既存抗体の存在: 多くの人はAAVに自然感染しており、中和抗体を持っています。これらの抗体は投与されたAAVベクターを中和し、遺伝子導入効率を低下させる可能性があります。血清型によって抗体保有率は異なり、例えばAAV2に対する抗体保有率は成人で約70%と高いのに対し、AAV8やAAV9は比較的低いとされています。
- 細胞性免疫応答: AAVカプシドタンパク質に対するT細胞応答が誘導され、AAVに感染した細胞が排除される可能性があります。これにより、遺伝子発現の持続性が損なわれることがあります。
これらの免疫応答に対する対策として、以下のアプローチが研究されています。
- 免疫抑制剤の併用
- カプシドタンパク質の改変による免疫原性の低減
- 代替投与経路の検討
- 血清型の選択や改変型AAVの使用
AAVの積載容量の制限
AAVベクターの最大の技術的制約の一つは、積載可能な遺伝子サイズが約4.7kbに制限されることです。これにより、ジストロフィンやCFTRなどの大きな遺伝子の導入が困難となります。この制限に対処するため、以下の戦略が開発されています。
- 遺伝子の分割と複数のAAVベクターの使用（デュアルAAVアプローチ）
- ミニ遺伝子やマイクロ遺伝子の使用
- トランススプライシングを利用した遺伝子再構成
ゲノム編集技術との融合
近年、AAVベクターはCRISPR-Cas9などのゲノム編集技術と組み合わせて使用されることが増えています。この組み合わせにより、単なる遺伝子補充療法ではなく、遺伝子変異の直接修復が可能となります。AAVはゲノム編集コンポーネントを効率よく細胞に送達するベクターとして理想的であり、以下のような応用が研究されています。
- 点変異の修復
- 遺伝子ノックアウト
- 遺伝子ノックイン
- エピゲノム編集
ただし、オフターゲット効果や免疫原性